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ARTÍCULO ORIGINAL
Subpoblaciones de linfocitos T en jóvenes supuestamente sanos
Subpopulations of T lymphocytes in young people supposedly healthy
Maritza Linares Guerra1, Nohary Fonte Medina2, Julio E. Conchado Martínez3, Orlando Barrera Romero4.
1Licenciada en Bioquímica. Profesor auxiliar. Facultad de Ciencias Médicas de Pinar del Río.
2Licenciada en Bioquímica. Asistente. Facultad de Ciencias Médicas de Pinar del Río.
3Doctor en Ciencias Médicas. Profesor titular. Facultad de Ciencias Médicas de Pinar del Río.
4Técnico de laboratorio. Facultad de Ciencias Médicas de Pinar del Río.
RESUMEN
Se estudió el comportamiento de las subpoblaciones de células T (CD3+CD4+y CD8+) y del indice CD4/CD8, en sangre periférica de jóvenes supuestamente sanos, haciendo utilización de un método simple que empleo anticuerpos monoclonales y la microscopia óptica. Se evaluaron 19 jóvenes (9 del sexo masculino y 10 del femenino). Los resultados arrojaron que los porcentajes de las subpoblaciones de células T y del indice CD4/CD8 para la muestra estudiada se acercan mas a los reportes de otros estudios por citometría de flujo que a los obtenidos por microscopia de fluorescencia. Por otra parte no se encontró significación estadística al comparar los resultados de todos los parámetros estudiados para ambos sexos, por lo que se concluye que en la muestra evaluada, las subpoblaciones de células T y el indice CD4/CD8 tuvieron una evolución independiente del sexo.
DeCS: LINFOCITOS; ANTICUERPOS MONOCLONALES; INMUNOHISTOQUIMICA; ADOLESCENCIA.
ABSTRACT
The behaviour of subpopulation of T cells (CD3+, CD4+ and CD8+)and the CD4 /CD8 index was studied in the peripheral blood of supposedly health youngsters using asimple method by means of monoclonal antibodies and optic microscopy. Nineteen youngsters were evaluateed ( 9 male and 10 female ). Results showed that percentages of subpopulations of T cells and CD4 /CD8 index for the studied sample are closer to the reports of other studies by flow citrometry than to the results obtained byfluorescence microscopy.On the other hand, no statistic significance was found when comparing the results of the parameters studied for both sexes, concluding that in the sample under evaluation the subpopulation of T cells and CD4 /CD8 index had an evolution independent to sex .
DeCS: LYMPHOCYTES; MONOCLONAL ANITBODIES; IMMUNOCITOCHEMISTRY; ADOLESCENCE.
INTRODUCCIÓN
Desde el ano 1975, en el que G. Kohler y C. Milstein publicaron el método para la obtención de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales (AcM),1 esta tecnología se ha extendido a diferentes áreas, provocando un considerable avance de la bibliografía y la biomedicina. Uno de los aspectos mas estudiados con AcM ha sido el de los antígenos de diferenciación celular de la membrana linfocitaria, lo cual ha permitido la caracterización de subpoblaciones funcionalmente diferentes de linfocitos T.
La determinación de las subpoblaciones CD3+, CD4+ y CD8+ de los linfocitos T le ha permitido a muchos investigadores estudiar inmunológicamente a pacientes con trastornos relacionados con el sistema inmune, por ejemplo, en el síndrome de inmunodeficiencia humana (SIDA),2 en los cuales el descenso del numero de células T CD4+ está considerado como el mas potente marcador predictivo de evolución del enfermo tal como indican estudios recientes.3 En pacientes con linfomas no Hodking y Hodking se ha encontrado disminución del porcentaje de células T CD3+ y alteraciones en las subpoblaciones CD4+ y CD8+ aunque no de manera significativa con respecto a los controles,4 además se ha reportado, escasa población de linfocitos T CD4+ y CD8+ en pacientes con carcinomas basocelulares y epidermoides de piel5 así como un bajo indice CD4/CD8 en niños con anemia ligera por deficiencia de hierro.6
El comportamiento de estas subpoblaciones de células T también se ha estudiado en enfermedades como la artritis reumatoidea7 y la cirrosis biliar primaria,8 por otra parte los anticuerpos monoclonales anti-CD3 se han empleado para estudiar las variaciones intercelulares de calcio de acuerdo a la edad, el sexo y la restricción de la dieta.9
Las técnicas mas empleadas en la cuantificación de las subpoblaciones linfoides, utilizando AcM, son la inmunofluorescencia indirecta y la citometría de flujo, sin embargo en los últimos años en nuestro país se ha establecido un método simple de realizar, que no requiere equipamiento especial y que constituye una alternativa atractiva para la determinación de subpoblaciones linfoides en pacientes con desordenes en el sistema inmune humano, este método inmunocitoquímico se basa en el uso de la microscopia óptica.
Con el presente trabajo se pretende describir a través de un estudio preliminar, el comportamiento de las subpoblaciones CD3+, CD4+, CD8 de los linfocitos T y del indice CD4/CD8 en un grupo de jóvenes supuestamente sanos, así como analizar la influencia del sexo sobre estos parámetros en la muestra estudiada.
MATERIAL Y MÉTODO
De una población de 56 alumnos internos del 1er ano de la especialidad de Medicina de la Facultad de Ciencias Medicas de Pinar del Río, durante el curso 95-96, se selecciono al azar una muestra de 19 alumnos supuestamente sanos con una proporción de edad entre 17 y 21 anos; de ellos 10 pertenecían al sexo femenino y 9 al masculino. A todos se le realizó un recuento total y diferencial de leucocitos de sangre periférica, previo consentimiento de los mismos a participar en el estudio.
Aislamientodelascélulas mononucleares periféricas.
Se recolectaron 6 ml de sangre periférica en tubos de cristal que contenían 340 micro-litro de EDTA como anticoagulantes, esta sangre fue disuelta 1:2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se adicionaron 6 ml de sangre diluida a otro tubo de centrifuga que contenía 3 ml de Visotranst, con una densidad de 1,077 g/ml, esta es una solución de contraste, que garantizo el aislamiento de las células mononucleares por gradiente de densidad después de centrifugar a 2500 rpm durante 25 minutos, a temperatura ambiente.
El anillo de células monomucleares fue extraído y resuspendido en 10 ml de PBS, después se centrifugo a 2000 rpm durante 5 minutos a 4 grados celcios, la píldora celular se lavo 2 veces con PBS-azida sódica (0,02%)-albumina sérica bovina (BSA) (1%). Posterior al último lavado la píldora se suspendió en 1 ml de PBS-azida-BSA. A partir de esta suspensión se determino la concentración celular y viabilidad por el método de exclusión por -tripan azul al 0,3%. Se ajusto la concentración celular a 1x10 a la 6 células por ml.
Se añadió 10 micro litro de la suspensión celular a cada pocillo de las laminas portaobjetos previamente preparadas con cromalum-gelatina. Se dejaron secar de 2-4 hrs a temperatura del laboratorio (20-30 grados celcius) y con deshumedificador. Las laminas se conservaron a 20 grados Celsius hasta el montaje de la microtécnica.
Estudio de las subpoblaciones de células T.
El porciento de células T CD3+, CD4+ y CD8+ en periferia fue estimado por medio de la microtécnica de inmunocitoquímica para la determinación de subpoblaciones linfoides con el uso de microscopia óptica (MICROptic) de acuerdo a lo sugerido por el Centro de Inmunológica Molecular (CIM) (10). En esta técnica se utilizaron los anticuerpos monoclonales de la serie ior-T3, ior-T4 e ior-T8 y antisueros policlonales conjugados a fosfatasa alcalina, todos suministrados por la casa de comercialización CIMAB S.A.
Microtécnica para la determinación de subpoblaciones linfoides usando microscopia óptica (MICROptic).
Una vez que las laminas conservadas a-20 (grados Celcios) alcanzaron la temperatura ambiente, se hidrataron con solución tampon Tris (TBS), durante 10 minutos y en los pocillos correspondientes se añadieron 10 microlitros de los anticuerpos monoclonales previamente diluidos: ior T3 (1:10), ior T4 (1:20) e ior T8 (1:20);esta reacción fue incubada 20 minutos a temperatura ambiente, posteriormente las laminas se lavaron con TBS frío durante 10 minutos y se añadieron 10 microlitros de antiraton diluido 1:20 a cada pocillo, después se incubaron las láminas en las mismas condiciones y se hicieron dos lavados de 5 minutos cada uno con TBS frío, posteriormente se añadieron a cada pozo 10 microlitros del conjugado de fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (APPAP) diluido 1:20, posterior a la incubación se repitieron de nuevo los pasos de lavado, adición del anti-ratón y del APPAP. Después de lavar 10 minutos con TBS, se adicionaron a cada pozo 10 microlitros de la solución sustrato-cromógeno (NAFTOL-NNDFM-Levamisol) mas fast-red y se esperaron entre 3 y 5 minutos para el ior T4 e ior T8 y 10 minutos para el ior T3.
La reacción se detuvo enjuagando las láminas con agua corriente, posteriormente las células se fijaron con formaldehido al 37% durante 10 minutos y los nucleos fueron tenidos con 10 microlitros de verde metilo, se realizo una incubación a 60 (grados celcios) durante 10 minutos y se enjuagaron dos veces con agua corriente, se dejo secar al aire y posteriormente se monto el cubreobjeto con glicerina-gelatina.
La lectura se realizo en microscopio óptico, utilizando una lente de 40X o uno de inmersión 100X, se contaron como mínimo 200 células y se estimó el porciento de células positivas según la siguiente formula:
Se calcularon las medidas aritméticas y las desviaciones standards del porciento de células CD3+, CD4+ CD8+ y del indice CD4/CD8, además para determinar si existían diferencias significativas desde el punto de vista estadístico según el sexo, en los parámetros anteriores, se aplicó la prueba no paramétrica de comparación de medias de Kolmogorv-Smirnov.
RESULTADOS
En la tabla 1 aparecen reflejados los valores individuales de las subpoblaciones de células T y del indice CD4/CD8 de todos los integrantes de la muestra.
En la tabla 2 se representan los proporciones de normalidad expresados en porcientos para las diferentes subpoblaciones de células T (CD3+, CD4+, CD8+) y del indice CD4/CD8, encontrados en la muestra estudiada por medio de la MICROptic, utilizando los anticuerpos monoclonales cubanos de la serie ior t3 ior t4 e ior t8, y los resultados de estas mismas determinaciones obtenidos por otros investigadores utilizando la microscopia de fluorescencia y la citometría de flujo así como AcM comerciales (OKT3, OKT4 y OKT8).
El porciento de reconocimiento especifico para los AcM de la serie IOR (T3, T4, T8) encontrado por el método de MICROptic en el CIM y en el presente estudio, aparecen representados en la tabla 3, este parámetro se expresa teniendo en cuenta la amplitud de la proporción de normalidad encontrado en ambos estudios.
En la tabla 1 aparece representado la evolución de la subpoblacion de células T y del indice CD4/CD8 según el sexo.
DISCUSIÓN
Los valores obtenidos para los leucocitos totales y el diferencial de los linfocitos concuerdan con los aceptados internacionalmente como cifras normales en las proporciones de edades de los sujetos evaluados.11
Los resultados obtenidos en el presente trabajo con la MICROptic son bastante similares a los encontrados por otros autores (Tabla 2), pero se acercan mucho mas a los obtenidos con la citometría de flujo según lo reportado por Lorigados LC et al 12 quienes por su parte, al utilizar la técnica de inmunofluorescencia indirecta para el estudio de las subpoblaciones linfocitarias encontraron valores para todas sus poblaciones de linfocitos T, inferiores a los reportados por citometría de flujo. Por otra parte, el CIMAB. SA en una información sobre reporte de producto destaca los resultados de unos estudios coordinados entre el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" y el Centro de Inmunología Molecular en el cual comparan el porciento de células T (CD4+) en 60 muestras de pacientes infectados con el VIH obtenido por el MICROptic y la citometría de flujo, los resultados de este estudio arrojaron un coeficiente de correlación de 0.95, lo que demuestra gran similitud entre los resultados que se obtienen por ambas técnicas.10
Observe que los valores encontrados por nosotros para las subpoblaciones de células T (CD3+, CD4+ y CD8+) según aparece en la tabla 3, tienen una mayor amplitud que los que reporta el CIM, sin embargo fue imposible comparar estos resultados desde el punto de vista estadístico ya que el CIM no reporta las características de la muestra en la que se realizo el estudio, ni el tipo de método enzimático empleado en el desarrollo de la microtécnica.
Es de destacar que aunque se observa una tendencia de las células T (CD4+) y del indice CD4/CD8 a ser superiores en el sexo masculino y las de CD8+ en el femenino (Tabla 4), para ninguno de estos parámetros, estas diferencias resultan significativas desde el punto de vista estadístico, por lo que en la muestra evaluada, la subpoblaciones de células T (CD3+, CD4+ y CD8+) y el indice CD4/CD8 tuvieron un evolución independiente del sexo. Estos resultados no coinciden con los reportes realizados por otros investigadores 13,14 quienes comprobaron que el indice CD4/CD8 de las células T en humanos esta genéticamente controlado y que varia significativamente con la edad y entre el sexo masculino y femenino. Los resultados encontrados en el presente estudio pudieran deberse a que el tamaño de la muestra estudiada fue muy pequeño, ya que si tenemos en cuenta la tendencia en el comportamiento de las subpoblaciones CD4+ y CD8+ así como el indice CD4/CD8, nos atreveríamos a asegurar que con una muestra superior para ambos sexos, las diferencias encontradas serian mucho mas evidentes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 9 de enero de 1997.
Aprobado: 23 de enero de l997.
Lic. Maritza Linares Guerra. Facultad de Ciencias Medicas km 89 Carretera Central, Pinar del
Río, CP. 20200 Cuba.
Copyright (c) 1969 Maritza Linares Guerra, Nohary Fonte Medina, Julio Conchado Martínez, Orlando Barrera Romero
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